高效PCR产物T-A克隆法及影响因素分析
作者：孙奋勇 万大方 顾健人
单位：孙奋勇 万大方 顾健人(上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室 (上海 200032)
关键词：聚合酶链反应；克隆，分子
肿瘤000422 中图分类号：Q785 文献标识码：B 文章编号：1000-7431(2000)04-0293-02
随着PCR及其相关技术的不断发展和完善，其应用范围日益广泛，如何方便、快捷和高效地克隆PCR产物越来越成为众多研究者关注的焦点。克隆PCR产物有若干好处，一是有利于测序，二是方便产物的大量制备，从而满足利用其作为探针进行各种杂交反应及功能研究的需求。目前，T-A克隆载体已被广泛使用，但都是商品化的载体，价格昂贵，数量较少，而且也存在不少问题。一些特殊类型的PCR反应，如RACE等，成本较高，一般实验室均采用较小的反应体积，加上切胶回收又要损失一部分，通常用于连接的PCR产物只有数个纳克，因此如何提高连接及转化效率是实验成败的关键。笔者根据Marchuk等介绍的方法[1]自制T-A载体并克隆了一段PCR产物，但发现效率较低，且背景很高，本文结合高压电穿孔技术明显提高了克隆效率，并讨论了各种因素对克隆效率的影响。此法简便易行，值得推广。
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材料和方法
材料 Taq酶(Promega)，DNA连接酶(Boehronger),EcoRV、PstⅠ、HindⅢ、X-gal、IPTG(GTBCO)，胶回收试剂盒(Wartson)。
T-A克隆载体的构建方法 用碱袭解法抽提pBluscript SK(-)质粒，用0.8 %的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果并定量。取5 μg质粒，以限制性内切酶EcoRV切成平端，电泳鉴定酶切是否完全，柱离心式回收试剂盒回收酶切片段。Taq酶处理载体在50 μl反应体系中进行，加入1 μg EcoRV酶切的SK质粒，2U Taq酶，10× buffer 5 μl,10 mmol/L dTTP 5 μl，75 ℃ 2 h。
PCR产物的克物 将PCR产物在1.5 %的琼脂糖凝胶上电泳，切胶回收并定量，取自制T-A克隆载体，按插入片段与载体摩尔数比3∶1的比例在T4 DNA连接酶的作用下，连接过夜。然后分别利用CaCl2和高压电穿孔法制备感受态细胞[2]，并以连接产物转化，在X-gal/IPTG LB固体培养基上进行蓝白斑筛选。
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用限制性内切酶对蓝白斑进行鉴定 从培养基上，分别挑取数个菌落，接种于5 ml LB培养液中，扩增12 h，抽提质粒，PstⅠ和HindⅢ酶切，1 %琼脂糖电泳鉴定是否含有插入片段。
结果与讨论
T-A克隆的原理是：Taq酶具有非模板依赖的活性，可在PCR双链产物的每一条链的3’端加上一个A；在仅有dTTP存在的情况下，该酶也可将切成平端的质粒3’端加上单个T。这样，PCR产物的3’末端与载体3’末端互补，连接酶作用下，进行粘端连接，较之平端连接效率较高[1]，作者用此方法克隆了一段PCR产物，从培养基上分别挑取4个白斑和1个蓝斑，抽提质粒，PstⅠ和HindⅢ酶切鉴定，结果4个白斑都得到单一的插入片段，蓝斑则未见插入片段(见附图)。
附图 用Pst1和HindⅢ酶切鉴定蓝白色菌落
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1～4白斑有插入片段，5蓝斑无插入片段
CaCl2和高压电穿孔法转化效率的比较 100 ng SK(-)超螺旋质粒分别用两种方法转化感受态细胞，CaCl2转化效率为4×106，高压电穿孔法转化效率8×107(单位：菌落数/1 μg超螺旋质粒)，后者为前者的20倍；取切胶纯化的PCR产物15 ng与10 ng的自制T-A载体进行连接，CaCl2法重组子数为8，高压电穿孔法为42，效率较前者提高5倍，表明高压电穿孔可以大幅度提高克隆效率。
Taq酶处理时间对连接效率的影响 质粒载体的粘端T是由Taq酶加上的，酶的品质，镁离子的浓度和作用时间都可能对连接效率产生影响。这里我们研究了作用时间的影响：EcoRV酶切SK(-)质粒8小时，Taq酶分别处理10 min、1、2、4 h，各取10 ng，连接12 h，电穿孔转化，重组子数目0、51、22、42，提示处理至少应在一小时以上，超过2小时则意义不大。
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连接反应时间对连接效率的影响 EcoRV酶切SK(-)质粒8小时，Taq酶处理2小时，各取10 ng，连接12、24、48 h，电穿孔转化，重组子数目35、42和30个。有文献报道，连接反应应为48 h，我们的结果显示，连接12 h已经足够，过长的时间毫无必要，还大大延长了实验周期。
EcoRV酶切时间对蓝斑数目的影响 自制T-A载体连接产物一般都有较高的背景，即蓝斑数目较多，虽然影响不大，但在连接物少，连接效率低的情况下，大量蓝斑会增加白斑挑取的难度。造成这种情况的原因是在制备载体时，EcoRV酶切不完全，而残存的环状质粒又有极高的转化效率，因此形成大量不含插入片段的蓝斑，虽然我们用电泳来鉴定酶切程度，但痕量的环状质粒是无法发现的，因此我们希望延长酶切时间来相对增加酶切程度。SK(-)质粒用EcoRV分别酶切20 min、2 h、8 h，各取10 ng，高压电穿孔转化感受态细胞，培养基上的蓝斑数目分别为400、56、60，提示酶切的时间至少应大于1小时。
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作者简介：孙奋勇，男，博士研究生。
参考文献
[1]Marchuk D,Drumm M,Sanlino A et al.Construction of T-vectors,a rapid and general system for direct cloning of unrelated PCR products〔J〕.Nucleic Acids Res,1991,19:1154
[2]F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿等著，颜子颖等译：精编分子生物学实验指南〔M〕.科学出版社，1998：22～23
(收稿日期：1999-10-10), 百拇医药
单位：孙奋勇 万大方 顾健人(上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室 (上海 200032)
关键词：聚合酶链反应；克隆，分子
肿瘤000422 中图分类号：Q785 文献标识码：B 文章编号：1000-7431(2000)04-0293-02
随着PCR及其相关技术的不断发展和完善，其应用范围日益广泛，如何方便、快捷和高效地克隆PCR产物越来越成为众多研究者关注的焦点。克隆PCR产物有若干好处，一是有利于测序，二是方便产物的大量制备，从而满足利用其作为探针进行各种杂交反应及功能研究的需求。目前，T-A克隆载体已被广泛使用，但都是商品化的载体，价格昂贵，数量较少，而且也存在不少问题。一些特殊类型的PCR反应，如RACE等，成本较高，一般实验室均采用较小的反应体积，加上切胶回收又要损失一部分，通常用于连接的PCR产物只有数个纳克，因此如何提高连接及转化效率是实验成败的关键。笔者根据Marchuk等介绍的方法[1]自制T-A载体并克隆了一段PCR产物，但发现效率较低，且背景很高，本文结合高压电穿孔技术明显提高了克隆效率，并讨论了各种因素对克隆效率的影响。此法简便易行，值得推广。
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材料和方法
材料 Taq酶(Promega)，DNA连接酶(Boehronger),EcoRV、PstⅠ、HindⅢ、X-gal、IPTG(GTBCO)，胶回收试剂盒(Wartson)。
T-A克隆载体的构建方法 用碱袭解法抽提pBluscript SK(-)质粒，用0.8 %的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果并定量。取5 μg质粒，以限制性内切酶EcoRV切成平端，电泳鉴定酶切是否完全，柱离心式回收试剂盒回收酶切片段。Taq酶处理载体在50 μl反应体系中进行，加入1 μg EcoRV酶切的SK质粒，2U Taq酶，10× buffer 5 μl,10 mmol/L dTTP 5 μl，75 ℃ 2 h。
PCR产物的克物 将PCR产物在1.5 %的琼脂糖凝胶上电泳，切胶回收并定量，取自制T-A克隆载体，按插入片段与载体摩尔数比3∶1的比例在T4 DNA连接酶的作用下，连接过夜。然后分别利用CaCl2和高压电穿孔法制备感受态细胞[2]，并以连接产物转化，在X-gal/IPTG LB固体培养基上进行蓝白斑筛选。
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用限制性内切酶对蓝白斑进行鉴定 从培养基上，分别挑取数个菌落，接种于5 ml LB培养液中，扩增12 h，抽提质粒，PstⅠ和HindⅢ酶切，1 %琼脂糖电泳鉴定是否含有插入片段。
结果与讨论
T-A克隆的原理是：Taq酶具有非模板依赖的活性，可在PCR双链产物的每一条链的3’端加上一个A；在仅有dTTP存在的情况下，该酶也可将切成平端的质粒3’端加上单个T。这样，PCR产物的3’末端与载体3’末端互补，连接酶作用下，进行粘端连接，较之平端连接效率较高[1]，作者用此方法克隆了一段PCR产物，从培养基上分别挑取4个白斑和1个蓝斑，抽提质粒，PstⅠ和HindⅢ酶切鉴定，结果4个白斑都得到单一的插入片段，蓝斑则未见插入片段(见附图)。
附图 用Pst1和HindⅢ酶切鉴定蓝白色菌落
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1～4白斑有插入片段，5蓝斑无插入片段
CaCl2和高压电穿孔法转化效率的比较 100 ng SK(-)超螺旋质粒分别用两种方法转化感受态细胞，CaCl2转化效率为4×106，高压电穿孔法转化效率8×107(单位：菌落数/1 μg超螺旋质粒)，后者为前者的20倍；取切胶纯化的PCR产物15 ng与10 ng的自制T-A载体进行连接，CaCl2法重组子数为8，高压电穿孔法为42，效率较前者提高5倍，表明高压电穿孔可以大幅度提高克隆效率。
Taq酶处理时间对连接效率的影响 质粒载体的粘端T是由Taq酶加上的，酶的品质，镁离子的浓度和作用时间都可能对连接效率产生影响。这里我们研究了作用时间的影响：EcoRV酶切SK(-)质粒8小时，Taq酶分别处理10 min、1、2、4 h，各取10 ng，连接12 h，电穿孔转化，重组子数目0、51、22、42，提示处理至少应在一小时以上，超过2小时则意义不大。
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连接反应时间对连接效率的影响 EcoRV酶切SK(-)质粒8小时，Taq酶处理2小时，各取10 ng，连接12、24、48 h，电穿孔转化，重组子数目35、42和30个。有文献报道，连接反应应为48 h，我们的结果显示，连接12 h已经足够，过长的时间毫无必要，还大大延长了实验周期。
EcoRV酶切时间对蓝斑数目的影响 自制T-A载体连接产物一般都有较高的背景，即蓝斑数目较多，虽然影响不大，但在连接物少，连接效率低的情况下，大量蓝斑会增加白斑挑取的难度。造成这种情况的原因是在制备载体时，EcoRV酶切不完全，而残存的环状质粒又有极高的转化效率，因此形成大量不含插入片段的蓝斑，虽然我们用电泳来鉴定酶切程度，但痕量的环状质粒是无法发现的，因此我们希望延长酶切时间来相对增加酶切程度。SK(-)质粒用EcoRV分别酶切20 min、2 h、8 h，各取10 ng，高压电穿孔转化感受态细胞，培养基上的蓝斑数目分别为400、56、60，提示酶切的时间至少应大于1小时。
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作者简介：孙奋勇，男，博士研究生。
参考文献
[1]Marchuk D,Drumm M,Sanlino A et al.Construction of T-vectors,a rapid and general system for direct cloning of unrelated PCR products〔J〕.Nucleic Acids Res,1991,19:1154
[2]F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿等著，颜子颖等译：精编分子生物学实验指南〔M〕.科学出版社，1998：22～23
(收稿日期：1999-10-10), 百拇医药